高中生物专题2课题2《土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》（选修1）
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《土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》 两个主要目的： （1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 （2）统计每克土样样品中究竟含有多少这样的细菌。 CO(NH2)2+H2O—（脲酶）→CO+2NH3 （一）筛选菌株 水生耐热细菌Taq 耐高温的Taq DNA聚合酶 美国微生物学克布鲁克 1966年发行耐热细菌 根据水生耐热细菌Taq筛选过程，P22旁栏思考？ 选择培养基 在微生物学中，将允许特点种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 （二）统计菌落数目 统计菌落数目的理论依据 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落。来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30~300的平板进行计数。 两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为10%的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230. 2、第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分布为21、212和256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为哪位同学的结果接近真实值？你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？ 说明设置重复组的重要性：第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力，第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误。因此，不能简单地讲3个平板的计数值用来求平均值，这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，在分析实验结果时，一定要考虑设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。 注意：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。 每克样品中的菌株数＝（C÷V）×M C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V：涂布平板时所用的稀释液的体积（ml） M：稀释倍数 （二）设置对照 在本课题的实验时，A同学从对应10^6倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选择大约50个菌落。 其他同学认为A同学的结果有问题。他们分析可能是A同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。 但是，A同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，A同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿不出令同学们信服的证据。 你能通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？ 究竟是哪个原因，可以通过实验来证明，实验方案有两种。一种方案是可以由其他同学用与A同学一样的土壤进行试验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。另一个方案是将A同学配置的培养基在不加同土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染，通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。 实验设计 [一]土壤取样 从肥沃、温润的土壤中取样，先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 [二]样品的稀释 样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目，实际操作中。通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30-300之间，适于计数的平板。 测定土壤中细菌的数量，一般选用10^4，10^5，10^6倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用10^4，10^5，10^6倍稀释；测定真菌的数量。一般选用10^4，10^5，10^6倍稀释，根据这些数据。请你思考胖栏中的问题。 当你第一次做这个实验的时候，可以得到稀释的范围放宽一点。例如，可以得10^5-10^5倍的稀释液分布涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30-300间的平板进行计数。 [三]微生物的培养与观察 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间，细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d；放线菌一般在25-28℃的温度下培养5-7d，而霉菌一般在25-28℃的温度下培养3-4d，本实验中，我们可以每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。这样可以防止因培养时间不是而导致遗漏菌落的数目。 一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基，温度及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。 操作提示 [一]无菌操作 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌 2、应在火焰旁称取土壤，在火焰附近将你称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作 [二]做好标记 注明培养基种类、培养日期，平板培养样品的稀释度等 [三]规划时间 结果分析 1、结合对照、分析培养物中是否有杂菌污染以及选培养基是否筛选出一些菌落 2、是否获得了某一稀释度下，菌落数目在30--300的平板，在这稀释度下，是否至少有两个平板的菌落数相近？ 3、你统计的每克土壤中含有分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？ 课题延伸 PH升高指示剂（酚红）将变红 CO(NH2)2+H2O—脲酶→CO2+2NH3 （一）空气中微生物总数的检测 （二）水中细菌总数的检测 （三）牛奶中细菌的分离与计数 （四）土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数
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